引言

在上一期的文章中，我們深入探討了雙誘導(dǎo)倉(cāng)鼠（金黃地鼠）肝S9在藥物毒理學(xué)研究中的核心價(jià)值，特別是其在亞硝胺類候選化合物遺傳毒性評(píng)估中的不可替代性。然而，一套高質(zhì)量的代謝活化系統(tǒng)只是加強(qiáng)Ames試驗(yàn)成功的一半。如何為亞硝胺類化合物選擇合適的陽(yáng)性對(duì)照（Positive Control），同樣是確保試驗(yàn)結(jié)果可靠、合規(guī)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

本文將系統(tǒng)闡述加強(qiáng)Ames試驗(yàn)（Enhanced Ames Test, EAT）中小分子亞硝胺類陽(yáng)性對(duì)照的選擇原則，并提供基于最新研究數(shù)據(jù)和監(jiān)管指南的實(shí)操建議。

一、為什么亞硝胺類需要“專門(mén)的"陽(yáng)性對(duì)照？

在傳統(tǒng)的Ames試驗(yàn)中，陽(yáng)性對(duì)照通常選用2-氨基蒽（2-AA）、苯并[a]芘（BAP）等標(biāo)準(zhǔn)致突變物，用于驗(yàn)證S9代謝活化系統(tǒng)的活性。然而，當(dāng)評(píng)估亞硝胺類化合物時(shí)，情況發(fā)生了變化（詳見(jiàn)圖1）。

（圖1：亞硝胺類陽(yáng)性對(duì)照在加強(qiáng)Ames試驗(yàn)中的作用示意圖）

亞硝胺是一類前致突變物（pro-mutagen），需要在肝臟中被CYP450酶系（主要是CYP2E1和CYP2C19）代謝活化后才能產(chǎn)生致突變活性。傳統(tǒng)的陽(yáng)性對(duì)照（如2-AA）雖然也能被S9活化，但其代謝途徑和酶譜需求與亞硝胺類存在顯著差異。使用與受試化合物代謝特征相匹配的陽(yáng)性對(duì)照，才能更準(zhǔn)確地驗(yàn)證S9系統(tǒng)對(duì)亞硝胺類化合物的代謝活化能力。

EMA在關(guān)于亞硝胺雜質(zhì)的指南中明確指出[7] ，加強(qiáng)Ames試驗(yàn)應(yīng)包含兩個(gè)亞硝胺類陽(yáng)性對(duì)照，最好根據(jù)待測(cè)亞硝胺的預(yù)期代謝特征進(jìn)行選擇。這標(biāo)志著亞硝胺類陽(yáng)性對(duì)照的選擇已經(jīng)從“通用型"轉(zhuǎn)向了“靶向型"。

二、亞硝胺類陽(yáng)性對(duì)照的推薦清單

綜合近年來(lái)多項(xiàng)關(guān)鍵研究數(shù)據(jù)（包括FDA優(yōu)化研究、HESI國(guó)際合作環(huán)試研究以及2025年發(fā)表的綜述分析）[1][4]，以下化合物已被確認(rèn)為適合在加強(qiáng)Ames試驗(yàn)中作為陽(yáng)性對(duì)照使用的亞硝胺類物質(zhì)。

2.1 核心推薦：NDMA 和 NDEA

NDMA和N-亞硝基二乙胺（NDEA）是短鏈烷基亞硝胺中較具代表性的兩個(gè)成員，也是目前在加強(qiáng)Ames試驗(yàn)中使用最為廣泛的陽(yáng)性對(duì)照。

一項(xiàng)系統(tǒng)研究對(duì)NDMA和NDEA的Ames試驗(yàn)檢測(cè)參數(shù)進(jìn)行了定性與定量分析，發(fā)現(xiàn)兩者的致突變性可以在Ames試驗(yàn)中輕松檢出，且最敏感的參數(shù)組合包括：30分鐘預(yù)孵育法、水或甲醇作為溶劑、誘導(dǎo)倉(cāng)鼠肝S9，以及TA100、TA1535和WP2 uvrA(pKM101)菌株。[1]

值得注意的是，NDMA在不同菌株中表現(xiàn)出差異化的反應(yīng)特征——在WP2 uvrA(pKM101)菌株中活性更高，而NDEA和CPNP則在TA1535和TA100菌株中更為活躍。[2] 因此，建議將NDMA和NDEA作為“菌株覆蓋型"陽(yáng)性對(duì)照組合使用，以全面驗(yàn)證不同突變檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)亞硝胺類化合物的響應(yīng)能力。[3]

2.2 擴(kuò)展推薦：NDPA 和 NDBA

除了NDMA和NDEA之外，研究還發(fā)現(xiàn)N-亞硝基二丙胺（NDPA）和N-亞硝基二丁胺（NDBA）也是合適的亞硝胺類陽(yáng)性對(duì)照選項(xiàng)。一項(xiàng)發(fā)表于2024年的比較研究明確指出，NDEA、NDPA和NDBA均可作為加強(qiáng)Ames試驗(yàn)中額外的亞硝胺陽(yáng)性對(duì)照使用。[1]

在實(shí)際應(yīng)用中，使用10%誘導(dǎo)大鼠S9或10%誘導(dǎo)/未誘導(dǎo)倉(cāng)鼠S9即可檢測(cè)到NDEA、NDPA和NDBA的致突變活性。這為實(shí)驗(yàn)室在陽(yáng)性對(duì)照選擇上提供了更大的靈活性。

三、陽(yáng)性對(duì)照的選擇策略與濃度優(yōu)化

3.1 基于待測(cè)化合物特征的分層選擇策略

建議采用以下分層策略來(lái)選擇陽(yáng)性對(duì)照(詳見(jiàn)圖2和表3）

（圖2：亞硝胺類陽(yáng)性對(duì)照分層選擇策略流程圖）

（表2：基于待測(cè)化合物特征的分層陽(yáng)性對(duì)照選擇策略）

3.2 S9濃度對(duì)陽(yáng)性對(duì)照響應(yīng)的影響

S9濃度的選擇直接影響陽(yáng)性對(duì)照的響應(yīng)強(qiáng)度，進(jìn)而影響試驗(yàn)的有效性判定。多項(xiàng)研究得出一致結(jié)論：30%倉(cāng)鼠S9產(chǎn)生的致突變響應(yīng)高于10% S9。[1][4]

一項(xiàng)涵蓋29種亞硝胺和17種NDSRI的大規(guī)模優(yōu)化研究顯示，使用TA1535和WP2 uvrA(pKM101)菌株組合、30分鐘預(yù)孵育、以及含30%倉(cāng)鼠肝S9的S9混合液，即可檢測(cè)到全部18個(gè)陽(yáng)性亞硝胺。[4]

對(duì)于NDMA，研究發(fā)現(xiàn)使用20%大鼠S9或10%倉(cāng)鼠S9即可檢測(cè)到顯著突變頻率。但需要警惕的是，過(guò)高的S9濃度可能對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生細(xì)胞毒性，導(dǎo)致突變頻率降低。研究建議將S9含量控制在10%即可獲得可靠結(jié)果，這同時(shí)符合3R原則。在實(shí)際操作中，建議采用雙濃度策略——使用10%和30%兩種S9濃度分別進(jìn)行測(cè)試，以兼顧靈敏度與細(xì)胞毒性控制。[1]

四、陽(yáng)性對(duì)照的濃度范圍與溶劑選擇

4.1 推薦濃度范圍

根據(jù)現(xiàn)有研究數(shù)據(jù)，亞硝胺類陽(yáng)性對(duì)照在Ames試驗(yàn)中的推薦濃度范圍如下（詳見(jiàn)表3），具體濃度需根據(jù)實(shí)驗(yàn)室歷史數(shù)據(jù)和方法驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)行微調(diào)[5] 。

（表3：亞硝胺類陽(yáng)性對(duì)照在Ames試驗(yàn)中的推薦濃度范圍）

4.2 溶劑選擇

溶劑的選擇對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響（詳見(jiàn)表4），研究表明[5] ，N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）和乙酸乙酯等溶劑即使在較低劑量下也會(huì)抑制S9酶的活性。相比之下，二甲基亞砜（DMSO）在高達(dá)1.6%（v/v）的濃度下仍表現(xiàn)出良好的兼容性，且溶解能力強(qiáng)、細(xì)胞毒性低，因此被推薦為亞硝胺EAT的推薦溶劑。水也被證明是兼容的溶劑。 

（表4：亞硝胺類陽(yáng)性對(duì)照在Ames試驗(yàn)中的推薦溶劑與注意事項(xiàng)）

4.3 純度要求

為避免假陽(yáng)性結(jié)果，所用陽(yáng)性對(duì)照化合物應(yīng)通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）確認(rèn)高純度（>98%）。此外，研究中還可采用谷胱甘肽共孵育策略，以淬滅過(guò)量的烷化劑，確保檢測(cè)到的是真實(shí)的致突變信號(hào)而非非特異性烷化作用。

五、陽(yáng)性對(duì)照在加強(qiáng)Ames試驗(yàn)中的質(zhì)量控制作用

加強(qiáng)Ames試驗(yàn)與傳統(tǒng)Ames試驗(yàn)在試驗(yàn)設(shè)計(jì)上存在多個(gè)關(guān)鍵差異[6][8] （詳見(jiàn)表5） ：

（表5：傳統(tǒng)Ames試驗(yàn)與加強(qiáng)Ames試驗(yàn)（針對(duì)亞硝胺）的關(guān)鍵參數(shù)）

陽(yáng)性對(duì)照在加強(qiáng)Ames試驗(yàn)中承擔(dān)著以下關(guān)鍵質(zhì)量控制功能[2] （詳見(jiàn)表6）：

（表5：傳統(tǒng)Ames試驗(yàn)與加強(qiáng)Ames試驗(yàn)（針對(duì)亞硝胺）的關(guān)鍵參數(shù)）

六、實(shí)操建議與常見(jiàn)問(wèn)題

Q1：如何確認(rèn)陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果是有效的？

陽(yáng)性對(duì)照組的回復(fù)突變菌落數(shù)應(yīng)達(dá)到陰性對(duì)照組的3倍以上，且該效應(yīng)應(yīng)在多個(gè)劑量點(diǎn)呈現(xiàn)劑量-反應(yīng)關(guān)系。同時(shí)，應(yīng)建立實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的歷史數(shù)據(jù)范圍（均值±2SD），用于日常結(jié)果判定。

Q2：如果NDMA和NDEA的響應(yīng)信號(hào)都很弱，可能是什么原因？

可能原因包括：（1）S9混合液中倉(cāng)鼠S9濃度不足或批次活性較低；（2）預(yù)孵育時(shí)間不足（應(yīng)確保30分鐘）；（3）溶劑對(duì)S9酶活性產(chǎn)生抑制；（4）陽(yáng)性對(duì)照溶液配制有誤或已降解。建議首先使用10%和30%倉(cāng)鼠S9進(jìn)行平行測(cè)試以排查S9相關(guān)因素。

Q3：對(duì)于NDSRI類雜質(zhì)，如何選擇合適的陽(yáng)性對(duì)照？

對(duì)于NDSRI類雜質(zhì)，EMA建議基于待測(cè)NDSRI的預(yù)期代謝特征來(lái)選擇陽(yáng)性對(duì)照。如果缺乏直接匹配的陽(yáng)性對(duì)照，可以組合使用NDMA/NDEA作為基礎(chǔ)陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)選用一個(gè)結(jié)構(gòu)相似、已知具有致突變活性的NDSRI作為補(bǔ)充陽(yáng)性對(duì)照。

Q4：陽(yáng)性對(duì)照的批次間差異如何處理？

建議每批新的陽(yáng)性對(duì)照溶液與歷史批次進(jìn)行平行測(cè)試，確保響應(yīng)強(qiáng)度在歷史數(shù)據(jù)范圍內(nèi)。陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)分裝保存，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致降解。

七、齊氏生物配套解決方案

齊氏生物不僅提供高品質(zhì)的PB/BNF雙誘導(dǎo)金黃地鼠肝S9產(chǎn)品，同時(shí)為客戶提供加強(qiáng)Ames試驗(yàn)配套試劑及技術(shù)咨詢服務(wù)：

結(jié)語(yǔ)

在加強(qiáng)Ames試驗(yàn)中，亞硝胺類陽(yáng)性對(duì)照的選擇并非簡(jiǎn)單的“拿來(lái)主義"。科學(xué)、合理的陽(yáng)性對(duì)照選擇策略，是確保S9代謝活化系統(tǒng)有效性驗(yàn)證準(zhǔn)確性的基石，也是滿足EMA、ICH M7(R2)等監(jiān)管要求的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

NDMA和NDEA作為經(jīng)典的短鏈烷基亞硝胺陽(yáng)性對(duì)照，是開(kāi)展亞硝胺類雜質(zhì)遺傳毒性評(píng)估的基礎(chǔ)選項(xiàng)；NDPA和NDBA可作為擴(kuò)展選擇，提供更廣泛的代謝覆蓋。結(jié)合30%倉(cāng)鼠肝S9、30分鐘預(yù)孵育以及TA1535/WP2 uvrA(pKM101)敏感菌株組合，可以較大化加強(qiáng)Ames試驗(yàn)的檢測(cè)靈敏度。

齊氏生物將持續(xù)為您提供專業(yè)的亞硝胺類陽(yáng)性對(duì)照選擇建議和技術(shù)支持，助力您的藥物雜質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作精準(zhǔn)、高效、合規(guī)！

參考文獻(xiàn)

[1] Dieckhoff J, Bringezu F, Simon S. Metabolic activation of short-chain alkyl N-nitrosamines using Aroclor 1254 or phenobarbital/beta-naphthoflavone-induced rat or hamster S9 – A comparative analysis[J]. Toxicology Reports, 2024, 12: 215-223.

[2] Bringezu F, Simon S. Salmonella typhimurium TA100 and TA1535 and Escherichia coli WP2 uvrA are highly sensitive to detect the mutagenicity of short alkyl-N-nitrosamines in the bacterial reverse mutation test[J]. Toxicology Reports, 2022, 9: 250-255.

[3] Shukla RM, Valani DT, Kajavadara CK, et al. Comparative analysis of TA102 and WP2 uvrA(pKM101) strains in detecting nitrosamine mutagens in the enhanced Ames test[J]. Environmental and Molecular Mutagenesis, 2025, 66(5): 291-297.

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Kajavadara CK, Valani DT, Patel SN, et al. Strain-specific mutagenicity of NDMA and CPNP: insights from TA1535, TA100, and WP2 uvrA(pKM101) under metabolic activation[J]. Environmental Toxicology and Pharmacology, 2025, 117: 104752.

[7] European Medicines Agency. Enhanced Ames test conditions for N-nitrosamines; Appendix 3 to Questions and answers for marketing authorisation holders/applicants on the CHMP Opinion for the Article 5(3) of Regulation (EC) No 726/2004 referral on nitrosamine impurities in human medicinal products (EMA/120337/2024)[S]. 2024.

[8] OECD. Test No. 471: Bacterial Reverse Mutation Test (Ames test)[S]. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Publishing, Paris, 2020.

本期是「代謝π析·倉(cāng)鼠S9專題」的第2篇，系統(tǒng)梳理了加強(qiáng)Ames試驗(yàn)中NDMA、NDEA等小分子亞硝胺陽(yáng)性對(duì)照的選擇策略。下一期我們將繼續(xù)深入探討一類更復(fù)雜的亞硝胺雜質(zhì)——NDSRI（原料藥相關(guān)亞硝胺雜質(zhì)），歡迎持續(xù)關(guān)注！